新型冠状病毒（2019 nCoV）RT-PCR检测试剂盒

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【产品名称】

新型冠状病毒（2019 nCoV）RT-PCR检测试剂盒（商品名：2019 nCoV qPCR）

【尺寸】

32人份/盒，48人份/盒，96人份/盒

【预期用途】

本产品用于快速检测人咽拭子或痰标本中2019-nCoV。

冠状病毒是一种带包膜的+ssRNA病毒。其直径约为80-120纳米。它的遗传物

质是所有RNA病毒中最大的。它是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要病原

体，可引起多种急慢性疾病。根据国际病毒分类委员会第九次报告《病毒分

类学》，冠状病毒科分为α、β和γ三属。其中，α冠状病毒（如人冠状病毒

229E、人冠状病毒NL63）、β冠状病毒（如人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、

SARS）可对人体造成不同程度的疾病。

冠状病毒感染者的常见症状是呼吸症状、发热、咳嗽、气短和呼吸困难。在更严重的情况下，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾功能衰竭，甚至死亡。“2019-nCoV”于2020年1月12日由世卫组织命名。

根据新《冠状病毒肺炎防治规划》（第6版）确诊病例要求，临床诊断病例或疑似病例有以下病原学证据：呼吸道或血样中2019-nCoV的RT-PCR检测结果为阳性。本试剂盒用于2019-nCoV的检测，有助于2019-nCoV感染的临床诊断。

【检测原理】

本品为基于荧光探针的Taqman-RT-PCR检测系统。首先用逆转录酶将2019-nCoV的RNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。在模板扩增过程中，Taqman探针因Taq DNA聚合酶的5'-3'聚合酶活性和外切酶活性而降解，分离荧光报告子和猝灭子使荧光信号能被仪器检测。FAM通道对2019-nCoV的ORF1ab基因进行定性检测，JOE通道对2019-nCoV的N基因进行定性检测，ROX通道对2019-nCoV的E基因进行定性检测，CY5通道对内参照物进行检测。

试剂盒中使用了dUTP和UNG酶，以防止扩增产物受到污染。

从样品采集开始，在试剂盒中使用内部参考进行质量控制。

【产品内容】

Components		Amount		Amount per reaction	Ingredient
	32 Tests/kit	48 Tests/kit	96 Tests/kit
2019-nCoV Reaction Reagent	448 μL	672 μL	672 μL*2	14 μL	dNTPs, MgCl2, Primers (ORF1ab gene, E gene and N gene of 2019-nCoV), Probes
RT-PCR Enzyme	192 μL	288 μL	288 μL*2	6 μL	Taq DNA polymerase, Reverse Transcriptase, UNG enzyme
Positive Control of 2019-nCoV	200 μL	200 μL	200 μL*2	-	Pseudovirus
Negative Control	200 μL	200 μL	200 μL*2	-	NaCl
Internal Reference A	160 μL	240 μL	240 μL*2	5 μL	Pseudovirus

注意：不要将不同批次的成分混合起来进行检测。人工构建2019株nCoV阳性对照和内参照系，均无传染性。

【储存和保质期】

所有试剂均应在-15℃～-25℃保存，密封避光，在推荐条件下保存12个月（待测定）。生产日期和有效期见标签。 套件应采用冷链运输或带冰的密封泡沫箱运输。室温下温度控制在-8℃以下，运输时间不超过4天。反复冻融次数应少于5次。

【仪器】

我们推荐平台使用新型冠状病毒（2019 nCoV）RT-PCR检测试剂盒：实时PCR仪——罗氏LightCycler 480、Life Technologies 7500、SLAN-96P。

【抽样处理】

1. 咽拭子：用聚丙烯纤维头塑料棒拭子同时擦拭双侧咽扁桃体和咽后壁，将拭子头浸入含生理盐水的试管中，丢弃尾部，拧紧管盖。

2. 痰：咳出呼吸道深处的痰，收集在容器中。液化法：取痰样加入等量乙酰半胱氨酸（10g/L），室温摇30分钟，充分液化后提取RNA。

3. 支气管肺泡灌洗：收集支气管肺泡灌洗液进行试验。 采集的样品应尽快用于检测。如果不能立即检测到需要转移的样品，请低温保存 样品在2~8℃下可保存24小时，在-70℃以下可长期保存。也可以存放在-20℃

4. 样品应按照生物安全规定低温运输。

   【协议】

1. 试剂制备 用冰盒制备试剂，按反应样品数（反应样品数，n=待测样品数+2对照样品+1）制备反应试剂： 向离心管中加入n×6μL RT-PCR酶和n×14μL 2019 nCoV反应试剂，摇匀，低速离心数秒，然后将20μL的等分试样放入不同的PCR反应管中。分离后反应管可放置在2~8℃下3小时。 2.RNA提取 建议使用我公司生产的RNA提取纯化试剂（通用型）、QIAamp病毒RNA小型试剂盒（Qiagen）和NX-48病毒RNA试剂盒（Genolution）从样品和对照样品中提取RNA。 待提取的样品体积为200μL，每个样品（包括参比物）加入5μL内参比物A；提取RNA后，10分钟内将提取的RNA加入反应管，或转移到离心管中，在-15℃～-25℃下保存。 3.模板添加 将提取的阴性对照品10μL，阳性对照品10μL，从样品中提取的RNA 10μL加入不同的PCR反应管中。低速离心。然后，把它们移到实时PCR仪器上。 4.PCR扩增 第一步：50℃15分钟，1个循环；第二步：95℃3分钟，1个循环 第3步：95℃5秒至60℃40秒，5个循环 步骤4：95℃5秒至60℃40秒，40个循环。在60℃下采集FAM、JOE、ROX和CY5荧光通道信号。 注：从ABI7500 RT-PCR软件操作界面的被动参考下拉菜单中选择“无”。 5.数据分析（ABI7500） PCR反应后需要保存检测数据文件。请分别设置FAM、JOE、ROX和CY5通道的参数和分析结果。 （1） 基线设置：可根据放大曲线形状自动设置或调整基线。 （2） 阈值设置：阈值应高于本试剂盒中阴性对照的最高荧光值。

1. 质量控制 阴性对照和阳性对照为试剂盒提供校准，并应为每次试验设置。如果满足以下所有条件，则结果有效。否则，测试无效。在这种情况下，应检查仪器、试剂、放大条件等的误差，并重复试验。

Products of Quality Control	Requirements of Quality Control
	FAM Channel	JOE Channel	ROX Channel	CY5 Channel
Positive Control of 2019-nCoV	Ct ≤ 32	Ct ≤ 32	Ct ≤ 32	No requirement
Negative Control	Undet	Undet	Undet	Ct ≤ 32

1. 解释测试结果

解释每个通道的测试结果

FAM有扩增信号，Ct≤36，扩增曲线呈典型的S型，其次为ORF1ab基因阳性，否则为ORF1ab基因阴性。

JOE有扩增信号，Ct≤36，扩增曲线为典型的S形，则为N基因阳性，否则为N基因阴性。

ROX有扩增信号，Ct≤36，扩增曲线呈典型的S形，然后为E基因阳性，否则为E基因阴性。

如果FAM、JOE和ROX的Ct值大于36或无值，CY5的Ct值大于32或无值，则样本或手术有问题，需要重新检测。

根据上述信道检测结果，判断结果如下：

Test Results	Interpreting Test Results
ORF1ab gene (+), N gene (+), E gene (+)； OR ORF1ab gene (+), N gene (+), E gene (-)； OR ORF1ab gene (+), N gene (-), E gene (+)； OR ORF1ab gene (-), N gene (+), E gene (+).	2019-nCoV (+)
Only ORF1ab gene (+)	Test again, and if repeated: 2019-nCoV (+)
Only N gene (+) or E gene (+)	2019-nCoV (-)
ORF1ab gene (-), N gene (-), E gene (-)	2019-nCoV (-)

【截止值或参考间隔】

2019-nCoV的截止值为Ct≤36。

【分析说明】

1. 实验室环境和试剂的污染，或样品处理过程中的交叉污染可能导致假阳性结果。 2.试剂在运输、储存、操作过程中如有差错，可能导致检测效果下降，甚至出现假阴性结果。 3.2019-nCoV早期感染或其他呼吸道病毒感染不能排除阴性结果的患者。如果条件允许，建议收集更敏感的样本，如痰或支气管肺泡灌洗液，以便重新测试。

   【分析限制】

1. 本试剂盒检测阳性结果不能表明体内是否存在病毒。建议同时采用其他方法进行确认。 2.本试剂盒用于2019年nCoV的分类和检测。结果仅供临床参考，应结合患者的症状/体征、病史、其他实验室检查和治疗反应考虑患者的临床治疗。 3.虽然该试剂盒检测到的靶序列是2019年nCoV基因的保守区，但在理论上无法完全避免对保守区罕见突变冠状病毒类型的漏检。

   【性能规范】【性能

   【性能规范】

   阴性对照符合率：15份企业参考样品（T1-T15）2019份nCoV检测结果为阴性，阴性对照符合率（-/-）为15/15。 阳性对照符合率：5份企业参考样品（Y1-Y5）2019份nCoV检测结果为阳性。 检测限：300份/mL。 重复性：企业参考样品（J1-J2）重复10次检测结果均为阳性，J1的Ct值变异系数（CV）小于5.0%。 精密度：连续检测5天，每人每天2次，每次重复4次，Ct值变异系数（CV）小于5.0%。 特异性：其他相关病原体（冠状病毒（229E，HKU1，OC43，NL63），甲型流感病毒（H1N1，H3N2），乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒（A，B型），副流感病毒（1，2，3，4a，4b型），鼻病毒（1A，1B，14，57型），腺病毒（3，7型），肠道病毒（71型），肺炎支原体，衣原体 肺炎；嗜肺军团菌（1型、2型、4型、6型、14型）、feeleii军团菌（1型）、伯明翰军团菌、micdadei军团菌、sainthelensi军团菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌（B型、C型）、葡萄球菌

   金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌（1、3、5、6、14、19型）、化脓性链球菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、卡他莫拉菌、绿脓杆菌、表皮葡萄球菌、痢疾志贺菌、空肠弯曲菌，蜡样芽孢杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、阪崎肠杆菌）。模拟样品中加入正常浓度的血红蛋白、白蛋白、粘液、抗真菌药物等干扰物质，不干扰试验结果。 临床试验初步结果：阳性对照符合率100.0%，阴性对照符合率97.8%，总符合率98.4%。

   【注意事项】

1. 本试剂盒仅用于体外诊断。 2.实验开始前请仔细阅读本手册。 3.实验中使用的所有设备均应消毒。 4.不合理的样品采集、转移、储存和操作可能导致错误的检测结果。 5.样品采集后应尽快进行RNA提取，避免降解。如果不能立即进行，则应按照[取样和处理]进行储存。 6.核酸提取机运行后，对使用过的消耗品进行封存。清洁仪器后，打开紫外线灯30分钟。 7.由于本试验涉及病毒RNA的提取和PCR扩增，请注意避免扩增反应混合物受到污染。建议定期监测实验室污染。 8.使用本工具包时，请严格按照说明操作。样品的采集、储存和转移、RNA的提取和检测、结果的解释必须严格按照试剂盒说明书的要求进行。样品的制备和添加过程必须按照临床基因扩增实验室的技术要求，在生物安全柜或其他基本防护设施中进行。 9.2019-nCoV具有较强的传输能力和高风险系数。个人防护应达到生物安全实验室三级水平。操作人员必须具备专业技能和PCR检验资格。在整个操作过程中，要防止气溶胶污染的感染风险，操作人员必须准确添加样品和使用试剂、消耗品。 10.为防止病毒传播，2019年nCoV必须在生物安全2级（P2）或以上实验室检测。实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理标准进行，实验操作必须严格划分。各区域使用的仪器、设备、消耗品、工作服必须严格区分，不得交叉使用，避免污染。 11.所有试验样品均应视为传染性物质。在实验过程中，应穿着工作服，经常佩戴和更换一次性手套，避免样品间的交叉污染。样品和废弃物的操作应符合《微生物生物医药实验室生物安全通用指南》、《卫生部医疗废弃物管理条例》等相关法律法规的要求。

   【参考】

   【参考】

1. 《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版）》Guidelines for laboratory testing of new coronavirus pneumonia prevention. 2020.

2. 《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第六版）》 New coronavirus pneumonia prevention and control program (6th ed) (in Chinese). 2020.

3. Clinical management of severe acute respiratory infection when novel coronavirus (nCoV) infection is suspected. WHO. 2020.

【一般信息】

Production license No.:国械注准 20203400299